《》：​用于辐照后感染伤口治疗的超分子材料

*仅供医学专业人士阅读参考光动力疗法（PDT）是一种通过产生活性氧（ROS）的光触发疗法，但传统的PDT可能存在实时光照的问题，这大大降低了治疗的依从性并导致光毒性。
来自北京化工大学的俞丙然、王振刚和徐福建团队报道了一种基于超分子光活性G-四方的材料，它由鸟苷（G）和4-甲酰基苯硼酸/1,8-二氨基辛烷自组装而成，在G4纳米线中加入核黄素作为光催化剂，用于辐照后的光动力抗菌治疗。
G4材料表现出类似水凝胶的特性，其为核黄素的装载提供了一个支架，并为核黄素提供了还原剂鸟苷，用于光触发产生治疗性H2O2。
光催化活性显示出对室温储存和加热/冷却处理的极大耐受性。
负载核黄素的G4水凝胶在光辐照后能够杀死革兰氏阳性细菌（如金黄色葡萄球菌）、革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）和耐多药细菌（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌），杀菌率超过99.999%。
辐照后的水凝胶在大鼠的感染伤口中也表现出了巨大的抗菌活性，从而揭示了这种新技术在光疗方面的潜力。
相关工作以题为“A H2O2-Supplied Supramolecular Material for Post-irradiated Infected Wound Treatment”的文章发表在2023年1月29日的国际顶级期刊《Advanced Science》。
创新型研究内容在这项工作中，将基于黄素的光催化分子催化剂与鸟苷衍生的超分子材料相结合，以获得抗菌活性（图1）。
在K+的存在下，鸟苷通过Hoogsteen碱基配对形成G-四边形图案（G4），这些图案堆积成G4线。
在4-甲酰基苯硼酸（4-FPBA）和1,8-二氨基辛烷的帮助下，G4被交联形成凝胶状材料。
黄素衍生物（如核黄素）通过化学共轭和堆叠作用被加载到水凝胶中，形成光催化超分子材料。
光敏黄素分子在光照下可以被激发，催化还原剂（如鸟苷）的氧化，然后将O2还原成H2O2。
图1 用于辐照后抗菌治疗的核黄素负载超分子水凝胶的形成示意图本研究发现，核黄素在460纳米左右有一个强吸收峰。
在蓝光（460纳米）的照射下，核黄素被激发为单子态，并通过系统内交叉（ISC）迅速转化为具有高氧化电位的三子态。
然后，作为活性物质的三子态被核苷还原为二氢核黄素（核黄素-H2），它被O2氧化形成静止态。
同时，O2被还原，生成H2O2（图2）。
本研究首先研究了核黄素介导的核苷酸的光催化氧化和H2O2的生成，在蓝光的照射下。
在辣根过氧化物酶（HRP）的存在下，H2O2会氧化TMB，形成比色的电荷转移复合物，其最大吸光度为652纳米。
H2O2的量可以通过监测652纳米处的吸光度变化来量化。
本研究发现吸光度与照射时间有关，在随后的实验中确定为10分钟。
在不同的鸟嘌呤衍生的核苷酸中，鸟嘌呤的氧化产生的H2O2量最高，可能是由于鸟嘌呤和核黄素之间的氢键和堆叠作用。
同样有趣的是，鸟苷的氧化导致的H2O2明显多于腺苷、尿苷和胞苷，这是因为鸟苷的电位比其他核苷低得多（E° vs NHE = 1.29 V] 通过使用核苷酸单磷酸酯（GMP、CMP、AMP或UMP）作为还原剂，本研究进一步证实了H2O2量对核碱基种类的依赖性。
图2 核黄素介导的光氧化和H2O2生成的催化循环和不同照射时间下核黄素介导的鸟嘌呤光氧化产生的H2O2量在超纯水中，在4-FPBA、1,8-二氨基辛烷和KCl的摩尔比为1:0.5:0.25的情况下，鸟苷可以自组装成G4-超分子材料。
如图1所示，鸟苷通过氢键形成G-四方结构，然后堆积成纳米纤维。
同时，鸟苷通过顺式二醇与硼酸反应形成环状酯与4-FPBA偶联，1,8-二氨基ocatane通过氨基与醛基的缩合以1/2的比例与4-FPBA共轭，最终导致G4纳米线的交联。
值得注意的是，在没有鸟嘌呤、4-FPBA或1,8-二氨基鸟嘌呤的情况下，或通过用Na+代替K+，溶液不能被固化（图3）。
傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示-OH（3300-3600 cm-1）、B-OH（1282 cm-1）和C=O（1662 cm-1）的消失，但出现了B-OC（1013 cm-1）和C=N（1695 cm-1）。
CN的形成得到了1H NMR光谱的进一步证实，该光谱显示了与4-FPBA相比，出现了-CH=N信号（δ=8.3ppm），以及减弱的-CHO峰（δ=9.8ppm）。
这些光谱结果证明了导致形成G4超分子材料的反应。
许多G4水凝胶是通过形成硼酸酯作为交联剂构建的，需要在碱性条件下将B（OH）3转化为B（OH）4。
相比之下，4-FPBA/1,8-二氨基辛烷/4-FPBA共轭物在两个末端都有-B（OH）2，每个末端都可以在生理pH下与鸟苷或核黄素的顺二醇反应，因此适合该水凝胶的生物应用。
图3 超分子G4-样品自组装的图像在核黄素负载的水凝胶材料中，鸟苷作为重要的构件，也是合成H2O2的原料。
在催化反应中没有添加外部还原剂。
在蓝光（460纳米）照射后，如SEM图像（图3）所示，没有观察到水凝胶的崩溃，核黄素负载的G4水凝胶材料的凝胶-溶胶温度和流变学特性（图4）也没有改变，这表明光催化材料的坚固性。
产生的H2O2的数量可以由核黄素的数量和照射时间控制。
在2×10-3 M核黄素的存在下，水凝胶照射10分钟后，在缓冲液中检测到约65×10-6 M H2O2，这表明有少量鸟苷被光激发的核黄素氧化。
这可能是因为核黄素通过化学共轭或堆积固定在G4线上，并且只氧化了靠近核黄素的鸟苷。
这种低产率的鸟苷氧化可能是超分子材料在光照射后保留凝胶状特性的原因。
光催化材料还显示出对室温储存和温度循环的耐受性。
图4 流变学曲线体外抗菌研究是通过在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）中将细菌与辐照后的核黄素负载的G4水凝胶进行共培养进行的。
如图5所示，在TSA中没有观察到细菌生长。
经过辐照后的核黄素负载的水凝胶杀死了金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）、大肠杆菌（革兰氏阴性菌）和MRSA（多药耐药菌），杀菌率超过99.999%，这可以归因于生成的H2O2。
光催化产生H2O2和抗菌研究是在不同的环境下实施的。
暴露在不同的抗菌组中的H2O2的数量没有差异。
值得注意的是，非辐照组也表现出轻微的抗菌活性，可能是由于生物活性核黄素的作用。
为了证实H2O2的作用，本研究在与细菌共培养之前，将过氧化氢酶与辐照后的核黄素负载水凝胶培养30分钟，发现水凝胶的抗菌活性被完全抑制了。
为了测试光催化系统的生物安全性，本研究将辐照后的核黄素负载的G4水凝胶与含有L929细胞的Dulbecco's modified eagle培养基（DMEM）孵化，该培养基与细菌浓度相同。
细胞存活率超过80%，表明产生的H2O2对L929细胞没有明显的细胞毒性。
图5 G4-水凝胶的体外辐照后抗菌效果通过在伤口上添加辐照后的水凝胶敷料，本研究检测了体内的抗菌活性。
本研究建立了一个由MRSA感染的大鼠伤口模型，以评估光催化核黄素-负载G4水凝胶的治疗效果。
将大鼠分为四组：没有任何伤口感染处理的空白组（空白组）；有伤口感染但没有添加核黄素负载水凝胶的对照组（对照组）；非辐照核黄素负载水凝胶组（非辐照组）和辐照后核黄素负载水凝胶处理组（辐照后组）。
大鼠的伤口感染治疗示意图见图6。
图6显示了不同组大鼠伤口形态的变化。
辐照后组的伤口组织匀浆稀释液在处理48小时后的菌落数量低于其他组，表明辐照后组由于产生了H2O2，在杀灭伤口中的细菌方面能力较强。
有趣的是，非辐照组也显示出轻微的杀菌活性，这与体外抗菌试验是一致的。
伤口组织的革兰氏染色切片图像显示，辐照后组的伤口组织的细菌数与空白组相似，证实细菌被辐照后的水凝胶有效杀死。
随后，为了进一步评估治疗效果，本研究测量了伤口组织匀浆中典型炎症因子的水平，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）或白细胞介素-6（IL-6）。
这些因子的水平在辐照后的组别中有所下降，这在120小时后死亡的大鼠中也有发现。
图6 活体辐照后的抗菌治疗综上所述，本研究提出了超分子核黄素负载的G4材料，其表现出凝胶状特性，用于感染伤口的辐照后抗菌治疗的概念验证。
G4水凝胶作为敷料材料，通过共价键和芳香族堆积将核黄素支架化，并为光激发的核黄素的还原提供还原剂鸟苷，然后通过O2还原产生H2O2。
辐照后的水凝胶在体外和体内对杀死革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和多药耐药菌表现出高效的抗菌活性，并表现出生物安全性和无明显的细胞毒性。
与需要实时照射的传统PDT不同，这项工作提出的照射后治疗依赖于H2O2，而H2O2的寿命要比高活性的∙OH或单线态氧等长得多。
因此，不需要将病人限制在照明源上，这可能会提高治疗的依从性。
同样值得注意的是，这些可能在核黄素光照过程中产生的∙OH或单线态氧并没有参与到抗菌治疗中，因为当照射后的水凝胶被转移到大鼠的感染部位时，有≈2分钟的间隔。
本研究的发现可能为光动力疗法提供了一个新的见解。
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